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從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)為微生物分離與純化。在分子生物學(xué)的研究及應(yīng)用中，不僅需要通過(guò)分離純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時(shí)注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”，防止其他微生物的混入。

1、用固體培養(yǎng)基分離和純化

單個(gè)微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長(zhǎng)、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見(jiàn)的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長(zhǎng)群體，稱(chēng)為菌落。當(dāng)固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時(shí)，便成為菌苔。不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征，可以成為對(duì)該微生物進(jìn)行分類(lèi)、鑒定的重要依據(jù)。大多數(shù)細(xì)菌、酵母菌、以及許多真菌和單細(xì)胞藻類(lèi)能在固體培養(yǎng)基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養(yǎng)。所謂平板，即培養(yǎng)平板的簡(jiǎn)稱(chēng)，它是指固體培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿，冷卻凝固后，盛固體培養(yǎng)基的平皿。這方法包括將單個(gè)微生物分離和固定在固體培養(yǎng)基表面或里面。固體培養(yǎng)基用瓊脂或其它凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基，每個(gè)孤立的活微生物體生長(zhǎng)、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。zui常用的分離、培養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養(yǎng)的技術(shù)簡(jiǎn)便易行，100多年來(lái)一直是各種菌種分離的zui常用手段。

1.1 稀釋倒平板法

首先把微生物懸液作一系列的稀釋?zhuān)ㄈ?:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。

1.2 涂布平板法

因?yàn)閷⑽⑸飸乙合燃拥捷^燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且采用稀釋倒平板法也會(huì)使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長(zhǎng)，因此在微生物學(xué)研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿，制成無(wú)菌平板，冷卻凝固后，將一定量的微生物懸液滴加在平板表面，再用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落（圖1）。

圖1 涂布平板法

1.3 平板劃線法

zui簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線法，即用接種環(huán)以無(wú)菌操作沾取少許待分離的材料，在無(wú)菌平板表面進(jìn)行連續(xù)劃線（圖2），微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開(kāi)來(lái)，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。有時(shí)這種單菌落并非都由單個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線”稀釋而達(dá)到分離目的的。劃線的方法很多，常見(jiàn)的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。

圖2 平板劃線法

1.4 稀釋搖管法

用固體培養(yǎng)基分離嚴(yán)格厭氧菌有特殊性，如果該微生物暴露于空氣中不立即死亡，可以采用通常的方法制備平板，然后置放在封閉的容器中培養(yǎng)，容器中的氧氣可采用化學(xué)、物理或生物的方法清除。對(duì)于那些對(duì)氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養(yǎng)的分離則可采用稀釋搖管培養(yǎng)法進(jìn)行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式。先將一系列盛無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)嚬苎杆贀u動(dòng)均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基和空氣隔開(kāi)。培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間。進(jìn)行單菌落的挑取和移植，需先用一只滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用一只毛細(xì)管插入瓊脂和管壁之間，吹入無(wú)菌無(wú)氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌刀將瓊脂柱切成薄片進(jìn)行觀察和菌落的移植。

2、用液體培養(yǎng)基分離和純化

大多數(shù)細(xì)菌和真菌，用平板法分離通常是滿(mǎn)意的，因?yàn)樗鼈兊拇蠖鄶?shù)種類(lèi)在固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，例如一些細(xì)胞大的細(xì)菌、許多原生動(dòng)物和藻類(lèi)等，這些微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來(lái)獲得純培養(yǎng)。

稀釋法是液體培養(yǎng)基分離純化常用的方法。接種物在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行順序稀釋?zhuān)缘玫礁叨认♂尩男Ч?，使一支試管中分配不到一個(gè)微生物。如果經(jīng)稀釋后的大多數(shù)試管中沒(méi)有微生物生長(zhǎng)，那么有微生物生長(zhǎng)的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。如果經(jīng)稀釋后的試管中有微生物生長(zhǎng)的比例提高了，得到純培養(yǎng)物的機(jī)率就會(huì)急劇下降。因此，采用稀釋法進(jìn)行液體分離，必須在同一個(gè)稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應(yīng)超過(guò)95%）表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。

3、單細(xì)胞（孢子）分離

只能分離出混雜微生物群體中占數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)的種類(lèi)是稀釋法的一個(gè)重要缺點(diǎn)。在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數(shù)。這時(shí)，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)，稱(chēng)為單細(xì)胞（或單孢子）分離法。單細(xì)胞分離法的難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比，較大的微生物如藻類(lèi)、原生動(dòng)物較容易，個(gè)體很小的細(xì)菌則較難。

較大的微生物，可采用毛細(xì)管提取單個(gè)個(gè)體，并在大量的滅菌培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項(xiàng)操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進(jìn)行。對(duì)于個(gè)體相對(duì)較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。在沒(méi)有顯微操作儀時(shí)，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進(jìn)行單細(xì)胞分離，例如將經(jīng)適當(dāng)稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取只含一個(gè)細(xì)胞的液體來(lái)進(jìn)行純培養(yǎng)物的分離。單細(xì)胞分離法對(duì)操作技術(shù)有比較高的要求，多限于高度專(zhuān)業(yè)化的科學(xué)研究中采用。

4、選擇培養(yǎng)分離

沒(méi)有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)條件能夠滿(mǎn)足一切微生物生長(zhǎng)的需要，在一定程度上所有的培養(yǎng)基都是選擇性的。如果某種微生物的生長(zhǎng)需要是已知的，也可以設(shè)計(jì)特定環(huán)境使之適合這種微生物的生長(zhǎng)，因而能夠從混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養(yǎng)出來(lái)，盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只占少數(shù)。這種通過(guò)選擇培養(yǎng)進(jìn)行微生物純培養(yǎng)分離的技術(shù)稱(chēng)為選擇培養(yǎng)分離，特別適用于從自然界中分離、尋找有用的微生物。自然界中，在大多數(shù)場(chǎng)合微生物群落是由多種微生物組成的，從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當(dāng)某一種微生物所存在的數(shù)量與其它微生物相比非常少時(shí)，單采用一般的平板稀釋法幾乎是不可能的。要分離這種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等，采用選擇培養(yǎng)分離的方法?；蛞种剖勾蠖鄶?shù)微生物不能生長(zhǎng)，或造成有利于該菌生長(zhǎng)的環(huán)境，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)后使該菌在群落中的數(shù)量上升，再通過(guò)平板稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純培養(yǎng)分離。

4.1 利用選擇平板進(jìn)行直接分離

根據(jù)待分離微生物的特點(diǎn)選擇不同的培養(yǎng)條件，有多種方法可以采用。例如要分離高溫菌，可在高溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)；要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上進(jìn)行分離；有些微生物如螺旋體、粘細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌等能在瓊脂平板表面或里面滑行，可以利用它們的滑動(dòng)特點(diǎn)進(jìn)行分離純化，因?yàn)榛心苁顾鼈冏约汉推渌荒芤苿?dòng)的微生物分開(kāi)。可將微生物群落點(diǎn)種到平板上，讓微生物滑行，從滑行前沿挑取接種物接種，反復(fù)進(jìn)行，得到純培養(yǎng)物。

4.2 富集培養(yǎng)

富集培養(yǎng)法原理和方法非常簡(jiǎn)單，利用不同微生物間生命活動(dòng)特點(diǎn)的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長(zhǎng)，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，很容易地分離到所需的特定微生物。富集條件可根據(jù)所需分離的微生物的特點(diǎn)從物理、化學(xué)、生物、及綜合多個(gè)方面進(jìn)行選擇，如溫度、pH、紫外線、高壓、光照、氧氣、營(yíng)養(yǎng)等等許多方面。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過(guò)多次重復(fù)移種，zui后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落。如果要分離一些專(zhuān)性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長(zhǎng)。通過(guò)多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。

5、二元培養(yǎng)物

分離的目的通常是要得到純培養(yǎng)。然而，在有些情況下這是很難做到的。但可用二元培養(yǎng)物作為純化培養(yǎng)的替代物。含有二種以上微生物的培養(yǎng)物稱(chēng)為混合培養(yǎng)物，而如果培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意識(shí)的保持二者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱(chēng)為二元培養(yǎng)物。例如二元培養(yǎng)物是保存病毒的zui有效途徑，因?yàn)椴《臼羌?xì)胞生物的嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物。有一些具有細(xì)胞的微生物也是嚴(yán)格的其它生物的細(xì)胞內(nèi)寄生物，或特殊的共生關(guān)系。對(duì)于這些生物，二元培養(yǎng)物是在實(shí)驗(yàn)室控制條件下可能達(dá)到的zui接近于純培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。另外，獵食細(xì)小微生物的原生動(dòng)物也很容易用二元培養(yǎng)法在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，培養(yǎng)物由原生動(dòng)物和它獵食的微生物二者組成。例如，纖毛蟲(chóng)、變形蟲(chóng)和粘菌。

在以上介紹的幾種方法中，平板分離法普遍用于實(shí)驗(yàn)室微生物的分離與純化。微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的單個(gè)菌落，通常是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體。因此可通過(guò)挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個(gè)菌落的方法可通過(guò)稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。